葡萄糖激酶基因及包装细胞系的构建下

葡萄糖激酶基因及包装细胞系的构建(下)

2 　结果

211 　GK基因重组逆转录病毒载体鉴定

2. 1. 1 　酶切鉴定PLX2GK经EcoR ⅠPBamH Ⅰ双酶切,1 %的琼脂糖凝胶电泳于1 450 bp 及5 800 bp 位置出现目的条带,与目的基因及载体片段大小相符(图1) 。

图1 　GK基因重组逆转录病毒载体酶切鉴定

2. 1. 2 　测序鉴定目的基因与Andreone3 文献中GKZ1 序列完全相同。

212 　病毒滴度测定

用PA317PGK病毒上清感染NIH3T3 细胞,在G418 选择培养基中,约3 周可见抗性细胞克隆形成,平均病毒滴度为6. 8 ×105 cfuPml ,最高1. 8 ×106 cfuPml 。

213 　产毒细胞系的鉴定

2. 3. 1 　PCR 鉴定(图2) PA317PGK细胞扩增出500 bp 的条带,而PA317PPLXSN 细胞未扩出相应条带。

图2 　产毒细胞中GK基因PCR鉴定

2. 3. 2 　S2P 免疫组化鉴定(图3) PA317PGK细胞的胞核、胞浆

中可见棕黄色阳性颗粒,而PA317PPLXSN细胞几乎未见阳性染色。

A: PA317 cell transfected with PLX2GK; B : PA317 cell transfectedwith PLXSN

3 　讨论

GK由465 个氨基酸构成,特异性存在于成熟肝细胞和胰岛β细胞中,参与糖代谢与胰岛素分泌过程中的多个重要环节。目前已经证明体内胰岛素分泌反应的强度与葡萄糖在胰岛β细胞内的代谢率成正比,因而控制葡萄糖流入β细胞速率的酶类被认为是调节胰岛素释放的葡萄糖传感器,GK就是β细胞内的葡萄糖传感器4 。GK活性直接或间接受血中葡萄糖浓度的调节,从而改变葡萄糖在β细胞内的代谢率,调节胰岛素分泌。同时该酶又可通过促进肝糖原合成,催化葡萄糖转化为62磷酸葡萄糖来调节血糖浓度,因而GK活性异常在糖代谢紊乱的发生发展中起着重要的作用。研究表明,在肥胖型糖尿病患者及一些动物模型中,如饥饿鼠、高脂饮食诱导的2 型糖尿病大鼠肝细胞GK活性均比正常明显下降5 ;另一些研究结果还表明,提高GK活性可显著降低血糖6 。另外,在糖尿病的候选基因中,GK基因也在其列,许多研究结果证明GK与MODY密切相关,其基因突变在MODY的发病中起着决定性的作用7 。因此,将GK基因应用于糖尿病的基因治疗有着广阔的应用前景。

将目的基因导入靶细胞获得长期稳定的表达是基因治疗的一个重要环节,而选择高效、稳定的转染载体是达到这一目的的关键。质粒和腺病毒载体虽可高效转染靶细胞,却不能将目的基因整合到染色体中长期、稳定表达,故不适于需长期表达的转基因治疗8 。逆转录病毒载体可将目的基因有效输入细胞核,高效整合并稳定表达,是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因载体。因此,我们构建了GK基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为下一步工作打下基础。

从实验中我们认为,要建立稳定并且高效的产毒细胞系,挑选的细胞集落数应较大,因为外源基因只是随机整合到包装细胞的基因组DNA 中,常常受正常机制的降解从细胞中排除出去,因而外源目的基因容易丢失。本研究中,我们挑选了50 个细胞克隆进行病毒滴度测定,大于1. 0 ×106 cfuPml 仍只占很小比例也说明了这一问题。从中我们筛选出一株滴度达1. 8 ×106cfuPml 的产毒细胞系并对其进行了PCR 及免疫组化鉴定,结果证实目的基因已稳定整合到PA317 细胞基因组中,并表达出GK蛋白。通过感染NIH3T3 细胞还充分证实了重组病毒的活性及其转染靶细胞的效率,为下一步的研究工作奠定了基础。

接着,我们准备将GK基因与人胰岛素原基因突变体9 一同转入细胞,获得长期、稳定的表达,并通过GK使该细胞的胰岛素表达受葡萄糖浓度的调节。进一步的动物体内实验,可望获得完全符合生理要求的胰岛素分泌,并通过GK促进葡萄糖磷酸化,以协同胰岛素控制血糖及其它代谢紊乱。

作者/郑宏庭,邓华聪,蹇　锐,兰丽珍,方　芳

信息来源:医学杂志

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